Análise da dieta de morcegos insetívoros em ambientes cavernícolas através de metabarcoding de eDNA

Abstract

Os morcegos insetívoros são apontadoscomo principais consumidores noturnos de insetos, incluindo espécies consideradas pragas agrícolas e vetores de doenças para humanos. Entretanto, amaioria das identificações dos artrópodes consumidos por morcegos é realizada através da observação direta dassuasfezes e/ou do conteúdo estomacal, dificultando a identificação específica das presas. Recentemente, técnicas moleculares não invasivas,como metabarcoding atrelado ao sequenciamento de alto rendimento, ampliaram a capacidade quali-quantitativa de identificação de itens alimentares em amostras fecais não apenas de morcegos, mas de vários outros organismos. Mediante este processo é possível realizar o sequenciamento simultâneo de milhões de genes extraídos de amostras de materiais conglomerados, comoo guano dos morcegos. Em uma abordagem pioneira para o Brasil, esta dissertação utilizou a técnica de metabarcoding para identificar e quantificar insetos presentes no guano de morcegos cavernícolas. Amostras de guano provenientes demorcegos insetívoros decavernas na Caatinga, na Mata Atlântica, e na Floresta Amazônica foram armazenadas em etanol 96%, em solução de estabilização RNA Laterou in naturae posteriormente congeladas em ultra freezer -80ºC, visando inicialmente o teste desses três métodos de estocagem de guano,dedois kits de extração de DNA e a padronização da amplificação, incluindo a escolha dos iniciadores para o gene mitocondrial Citocromo C Oxidase I. As sequências geradas foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A coleta de guano em todas as cavidades resultou num total de 397 amostras. Deste total, 250 amostras foram selecionadas para a extração do DNA. Para os testes de estocagem, extração e amplificação do DNA foram selecionadas doze amostras. O método de armazenamento mais eficaz foi in natura, seguido daquele com adição de buffer e por último a adição de etanol 96%. Para os testes de amplificação com os três conjuntos de iniciadores foram selecionadas13 amostras. Após os testes com os iniciadores, o fragmento de 130 pb foi selecionado para o sequenciamento de 29 amostras. Neste sequenciamento foram geradas 13.636 OTUs.Destas, 1.117 OTUs (8,2%) possuem similaridade igual ou acima de 97% com o banco dedados de nucleotídeos do NCBI e 401OTUs (2,98%) são representativas para táxons de artrópodes com similaridade igual/acima de 97%. Lepidoptera e Dipteraforam as ordens mais frequentes nas amostras, incluindo ao menos 10 espécies consideradas como pragas agrícolas ouvetores de doenças.Ariqueza e diversidade de presas identificadas neste estudo confirmam a eficiência daabordagem molecular na identificação de itens alimentaresconsumidos por morcegos e o importante papel desempenhado por elesna supressão de artrópodese na prestação dos serviços ecossistêmicos, principalmente quando suprimem artrópodes que podem causar prejuízos à agricultura e outros que podem ser transmissores de doenças.

ABSTRACTInsectivorous bats are regardedas the main nocturnal insect consumers, including species consideredharmful toagriculture and disease vectors for humans. Meanwhile, most studies concerning the diet ofinsectivorous areperformed by direct observation of itsfeces and/or stomach contents, making it difficult tocorrectlyidentify prey specimensand, thereforeto know if batsareindeed providingthose ecologicalservices. Recently, non-invasive molecular techniques, such as metabarcoding coupled with high-throughput sequencing, have enhanced the qualitative and quantitative ability to identify food items in fecalsamples,not only from bats but from several other organisms. Through this process,it is possible to carry out asimultaneous sequencing of millions of genes extracted from conglomerate materials’ samples, such as guano from bats. In a pioneering approach to Brazil, inmy MScdissertationIused the metabarcoding technique to identify and quantify insects present in the guano of cave bats.I collected and storedsamples of guano from insectivorous bats from caves in the Caatinga, Mata Atlântica and Amazon Forest, using three guano stocking methods: in 96% ethanol,in a stabilization solution of RNA Later andin natura; thenIfroze all the samples at -80ºC.Initially, Iaimed totestthethree guano stocking methodsused, two DNA extraction kits and the standardization of amplification, including the choice of primers for the mitochondrial Cytochrome C Oxidase I gene, and sequenced using Illumina technology. Allgenerated sequenceswere groupedinto operational taxonomic units (OTUs). In naturashowed to bethe most effectivestorage method, followed by RNA laterand 96% ethanolmethods. For the amplification tests with the three sets of primers, 13 samples were selected. After testing the primers, the 130 bp fragment was selected for the sequencing of 31 samples. In this sequencing, 13,805 OTUswere generated. Of these, 1,127 OTUs (8.2%) have similarity above 97% with the NCBI nucleotide database and 401 OTUs (2.98%) are representative for arthropod taxa withasimilarity above 97%.In this study, I found that Lepidoptera and Diptera werethe most frequent orders found in theguanosamples, including at least 10 species considered agricultural pests or vectors of diseases. The richness and diversity of prey identified in this study confirmthe efficacy of the molecular approach in identifying food items consumed by bats and their important role in suppressing arthropods and in providing ecosystem services, particularly when they suppress arthropods that can harmagriculture andto human health.